Dissertação
Título	Obtenção de seqüências expressas em túbulos de Malpighi de híbridos de bicho-da-seda infectados pelo “Bombyx mori” nucleopoliedrovírus múltiplo, BmMNPV
Autor	Takeda, Karen Izumi
Unidade	Pós-Graduação em Genética e Melhoramento
Área de Concentração	Genética e Melhoramento
Orientador	Profª Drª Maria Aparecida Fernandez
Co-Orientador(es)	Profª Drª Ana Silvia Lapenta Profª Drª Maria Claudia Colla Ruvolo Takasusuki
Banca Examinadora	Profª Drª Maria Aparecida Fernandez Profª Drª Ana Silvia Lapenta Profª Drª Maria Albertina de Miranda Soares
Data de Defesa	10/09/2009
Resumo	Bombyx mori, popularmente conhecido como bicho-da-seda, é um lepidóptero de grande importância econômica em razão do valor comercial da seda. O seu genoma foi estimado em 500 Mb e 432 mega bases (Mb) foram sequenciados em 2004 por dois grupos de pesquisadores, um japonês e um chinês. Com o sequenciamento do seu genoma, tornou-se possível explorar também o seu transcriptoma e proteoma, a fim de melhor compreender este lepidóptero, que tem tornado um organismo modelo. O bicho-da-seda é susceptível a várias doenças, sejam elas causadas por fungos, bactérias, protozoários ou vírus. As doenças virais são as de maior ocorrência, causando grandes perdas na produção de casulos e, consequentemente, prejudicando a economia sericícola. Um subgrupo múltiplo do nucleopoliedrovírus (BmMNPV) foi isolado no Estado do Paraná e vários trabalhos vêm sendo realizados com relação a sua infecção em lagartas do bicho-da-seda. Sabe-se que o vírus infecta vários órgãos, como a glândula da seda, traqueia, sistema nervoso central, porém, resultados não publicados apontam para a inexistência de infecção no órgão excretor do inseto, o túbulo de Malpighi, embora este apresente alterações morfofisiológicas. Assim sendo, no presente trabalho, o transcriptoma do túbulo de Malpighi de híbridos do bicho-da-seda foi analisado utilizando-se a metodologia ORESTES (Open Reading Frame Expressed Sequence Tag), a qual permite a obtenção de fragmentos centrais de genes, por meio de RT-PCR (Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction). A obtenção de sequências diferencialmente expressas foi realizada a partir da inoculação do vírus BmMNPV em lagartas no 5° instar larval, e os túbulos de Malpighi foram coletados nos seguintes períodos 24, 48, 72 e 96h, depois. A partir do RNA total foi obtido o mRNA (RNA mensageiro), sendo realizada a síntese de cDNA (DNA complementar), o qual serviu como molde para a realização da PCR Touchdown com primers aleatórios. Com os produtos de amplificação obtidos (perfis ORESTES) foi realizada a ligação em vetores de clonagem para a transformação em bactéria termo-competente, obtendo-se assim bibliotecas de cDNA. Foram sequenciados 414 clones, dos quais 168 sequências foram válidas, sendo que 5,36% são similares às sequências já depositadas em banco de EST’s de B. mori, 65,48% de sequências ORESTES e 21,43% não apresentam similaridade com sequências conhecidas, as quais podem representar novos genes do bicho-da-seda. Estas informações podem contribuir com a anotação genômica, assim como também contribuir com a determinação do transcriptoma do túbulo de Malpighi de B. morri, quando da infecção pelo BmMNPV.
Palavras-chave	bicho-da-seda, nucleopoliedrovírus, transcriptoma.
Title
Abstract	Bombyx mori, widely known as silkworm, is a lepidopteran of great commercial value due to the silk production. Its genome was sequenced in 2004 by two researchers groups, Japanese and Chinese, and 432 mega bases (Mb) was sequenced, of a total estimated in 500 Mb. With the genome sequencing, it became possible to explore also its transcriptome and proteome, in order to better understand this lepidopteran, which has become a model organism. Like all organisms, the silkworm is susceptible at various diseases, whether caused by fungi, bacteria, protozoa or viruses. The viral diseases are the most affecting silkworm, causing great losses in the cocoons production and, consequently, harming the silk economy. A multiple subgroup nucleopolyhedrovirus (BmMNPV) was isolated in the Parana State and many researches have been conducted with regard to its infection in silkworm larvae. It knows that the virus infects the silk gland, trachea, central nervous system, however unpublished results point to the absence of infection in the excretory organ of this insect, the Malpighian tubule, but it demonstrate morpho-physiological modifications. Thus, in this study, the transcriptome of the Malpighian tubule from silkworm strain hybrid was analyzed using the ORESTES (Open Reading Frame Expressed Sequence Tag) methodology, which allows getting central fragments of the genes by RT-PCR (Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction). The acquisition of differentially expressed sequences was carried out from BmMNPV virus inoculation in the 5th instar larvaes and the Malpighian tubules were collected at 24, 48, 72 and 96 hours post-inoculation (hpi). From the total RNA was obtained mRNA (messenger RNA), and it was used to the synthesis of cDNA (complementary DNA), which served as template for PCR Touchdown (PCR-TD) with random primers. With the amplification products obtained (ORESTES profile) was performed the ligation in cloning vectors for the transformation in chemical competent bacteria, thus obtaining cDNA libraries. It was sequenced 414 clones, of which was obtained 168 valid sequences, and 5.36% are similar to sequences already deposited in the EST’s B. mori database, 65.48% of ORESTES sequences and 21.43% have no similarity to known sequences, which they can represent new genes of the silkworm. These results can potentially contribute to the genomic annotation, as well as contribute to the transcriptome of the Malpighian tubule of B. mori determination when it is infected with BmMNPV.
Key-words	silkworm, nucleopolihedrovirus, transcriptome.
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