Dissertação
Título	Toxicidade e expressão de esterases em larvas de Diatraea saccharalis (Fabricius, 1794) (Lepidoptera; Crambidae) após contaminação com o inseticida regulador de crescimento novaluron
Autor	Batista, Andreya de Oliveira
Unidade	Pós-Graduação em Genética e Melhoramento
Área de Concentração	Genética e Melhoramento
Orientador	Maria Claudia Colla Ruvolo Takasusuki
Co-Orientador(es)	Erasmo Renesto e Claudete Aparecida Mangolin
Banca Examinadora	Sheila Michele Levy José Ricardo Penteado Falco
Data de Defesa	05/08/2010
Resumo	A Diatraea saccharalis é a principal praga da cana de açúcar, conhecida também por broca da cana-de-açúcar. Esse inseto ocasiona enormes prejuízos a essa cultura agrícola. O controle da D. saccharalis é realizado de forma integrada sendo utilizado o Hymenoptera parasita Cotesia flavipes no seu controle biológico. Além desse parasita são utilizados vários tipos de inseticidas. Dentre os agrotóxicos empregados podemos destacar o novaluron, um inseticida regulador de crescimento (IRC). Esse IRC é derivado de acylureas que inibem a síntese de quitina do inseto durante o período larval ou quando está iniciando a pupação. Contudo, seu mecanismo de ação continua desconhecido. Sem a formação da quitina o inseto não passa para o próximo estágio de desenvolvimento, sendo eliminado. A resistência a inseticidas pode ser originada por meio das esterases, enzimas de amplo espectro que apresentam rápida ligação e lento turnover do inseticida. As carboxilesterases ou esterases catalisam a hidrólise de um grande número de ésteres carboxílicos não ionizados. Essas enzimas participam da detoxificação do organismo do inseto, inclusive de xenobióticos. O presente estudo foi realizado com o objetivo de verificar prováveis alterações na expressão das esterases e na viabilidade em larvas de D. saccharalis decorrentes da contaminação crônica por ingestão, com doses subletais do inseticida regulador de crescimento novaluron. As larvas de D. saccharalis são mantidas no laboratório de criação do Departamento de Biologia Celular e Genética da Universidade Estadual de Maringá (DBC-UEM), sob temperatura de 25 ± 1°C, fotoperíodo de 12 a 14 horas, umidade de 70 a 10% e alimentadas com dieta artificial. Para cada instar larval foram realizados 8 bioensaios, sendo um controle e sete diluições do inseticida comercial (Gallaxy). A cada 24 horas foi verificada a quantidade de indivíduos mortos e vivos, sendo retiradas quatro larvas de cada bioensaio, para realizar a medida de comprimento, e quatro larvas eram sacrificadas e mantidas a -20°C para as análises eletroforéticas. Os bioensaios tinham a duração de 96 horas. As larvas sacrificadas foram submetidas a eletroforese em sentido vertical em géis PAGE 10% e coloração com α e β-naftil-acetato juntos de acordo com as técnicas para análise de esterases. A análise dos dados de mortalidade foi realizada com a metodologia de modelos lineares generalizados, considerando distribuição binomial e função de ligação logit para a variável mortalidade. O comprimento foi analisado em função da concentração de Novaluron e dos instares. Para esta característica foi considerada distribuição normal. A observação das larvas permitiu verificar que há alteração na cor das mesmas do primeiro ao terceiro instar. Foi observado também diminuição na mobilidade das larvas. As alterações no comprimento das larvas não foram significativas. Nas análises das esterases foi detectada inibição total da EST-6 em larvas de primeiro instar após 24 horas de contaminação. No segundo instar a inibição ocorreu com a EST-3 após 24 horas de contaminação. Nos demais instares não foram observadas alterações na atividade relativa das esterases. A toxicidade do novaluron apresentou diferenças dependendo da idade larval. O primeiro e o quarto instar apresentaram a menor toxicidade, sendo que no primeiro a maior mortalidade ocorreu após 24 horas na concentração de 12,5%, e no quarto instar a maior mortalidade ocorreu após 96 horas a 12,5%. Os demais instares (segundo, terceiro e quinto) apresentaram maior mortalidade após 72 horas de contaminação. A inibição das EST-3 e EST-6 podem estar associadas com a detoxificação do organismo das larvas, pois essas isoenzimas participam do metabolismo intermediário degradando xenobióticos. Além disso, já foi evidenciado que a resistência a IRC pode estar ligada a vias metabólicas não específicas e não a alterações do sítio alvo. Os resultados obtidos no presente estudo necessitam de novos experimentos de campo para verificar a sua aplicabilidade. O melhor período para aplicar o novaluron em culturas de cana-de-açúcar com infestação de D.saccharalis é o segundo instar, seus resultados serão observados após 72 horas da aplicação.
Palavras-chave	quitina, gallaxy, isoenzimas, mortalidade, cana-de-açúcar, broca da cana
Title
Abstract	The Diatraea saccharalis is the main plague of the sugarcane, also known for sugarcane borer. This insect causes enormous damages to this agricultural crop. The control of the D. Saccharalis is carried through of integrated form being used the Hymenoptera parasite Cotesia flavipes in its biological control. Beyond this parasite some types of insecticide of growth (IRC). This IRC is derived from we acylureas that inhibit the synthsis of quitina of the insect during the larval period or when it is initiating the pupation. However, its mechanism of action continues unknown. Without the formation of the quitina the insect does not pass to the next period of training to development, being eliminated. The resistance the insecticides can be originated by means of esterases, enzymes of ample specter that present slow fast linking and to turnover of the insecticide. Carboxilesterases or esterases catalyzes hydrolysis of a great not ionized carboxílicos ester number. These enzymes participate of the detoxificação of the organism of the insect, also of xenobióticos. The present study it was carried through with the objective to verify probable alterations in the expression of esterases and the viability in decurrent larvae of D. saccharalis of the chronic contamination for ingestion, with subletais (doses) of the regulating insecticide of growth novaluron. The larvae of D. saccharalis are kept in the laboratory of creation of the Department of Cellular and Genetic Biology of the University State of Maringá (DBC-UEM), under 25 temperature of ± 1°C, fotoperíodo of 12 the 14 hours, humidity of 70 fed 10% and with artificial diet. Each to urge larval had been carried through 8 bioassay, being a control and seven dilutions of the commercial insecticide (Gallaxy). To each 24 hours were verified the amount of dead individuals and livings creature, having been removed four larvae of each bioensaio, to carry through the measure of length, and four larvae were sacrificed and kept -20°C for the eletrophoretics analyses. The bioassays had the duration of 96 hours. The sacrificed larvae had been submitted eletrophoresis in vertical direction in together géis PAGE 10% and coloration with α and β-naftil-acetate in accordance with the techniques for analysis of esterases. The analysis of the mortality data was carried through with the methodology of generalized linear models, considering binomial distribution and function of linking logit for changeable mortality.The length was analyzed in function of the concentration of Novaluron and urging them. For this characteristic normal distribution was considered. The comment of the larvae allowed to verify that it has alteration in the color of the same ones of the first one to third urging. Reduction in the mobility of the larvae was also observed. The alterations in the length of the larvae had not been significant. In the analyses of esterases total inhibition of the EST-6 in larvae of first urging 24 hours of contamination after was detected. In as urging the inhibition it after occurred with the EST-3 24 hours of contamination. In excessively urging alterations in the relative activity of esterases had not been observdas. The toxicidade of novaluron presented differences depending on the larval age. First and the fourth to urge had presented the lesser toxicidade, being that in the first a bigger mortality after occurred 24 hours in the 12,5% concentration, and in the fourth to urge biggest mortality occurred 96 hours after 12.5%. Excessively to urge (second, third and fifth) had presented greater mortality after 72 hours of contamination. The inhibition of EST-3 and EST-6 can be associates with the detoxificação of the organism of the larvae, therefore these isozymes participate of the intermediate metabolism degrading xenobiotics. Moreover, already it was evidenced that the resistance the IRC can be on not specific the metabolic ways and not it alterations of the white small farm. The results gotten in the present study need new experiments of field to verify its applicability. Optimum period to apply novaluron in cultures of sugar cane-of-sugar with infestation of D.saccharalis is as to urge, its results will after be observed 72 hours of the application.
Key-words	chitin, gallazy, isoenzymes, mortality, sugarcane borer
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