Tese
Título	Polimorfismo mitocondrial em Tetragonisca angustula e Tetragonisca fiebrigi em-pregando marcadores PCR-RFLP
Autor	Santos , Simone Aparecida
Unidade	Pós-Graduação em Genética e Melhoramento
Área de Concentração	Genética e Melhoramento
Orientador	Maria Claudia Colla Ruvolo Takasusuki
Co-Orientador(es)	Claudete Aparecida Mangolin e Dra. Maria de Fátima Pires da Silva Machado.
Banca Examinadora	Marco Antonio Costa Claudete Aparecida Mangolin Hélio Conte Vagner de Alencar Arnaut de Toledo
Data de Defesa	07/03/2014
Resumo	Os meliponídeos são importantes polinizadores, participando da manutenção de espécies vegetais. Uma das espécies mais manejadas é a Tetragonisca angustula, conhecida popularmente como jataí. Incialmente foram identificadas duas subespécies de T. angustula, T. angustula angustula e T. angustula fiebrigi. Posteriormente, as T. a. fiebrigi foram elevadas a espécie baseado na diferente coloração encontrada na região do tórax denominada mesepisterno. Foram descritos híbridos das duas espécies, além de estudos realizados com marcadores moleculares nucleares com isoenzimas, RAPD e microssatélites, que apresentaram resultados controversos. O objetivo do trabalho foi a obtenção de marcadores genéticos que possam diferenciar as duas espécies por meio da amplificação de regiões do DNA mitocondrial (mtDNA) seguida pela técnica de PCR–RFLP. Foram utilizadas abelhas operárias de T. angustula e T. fiebrigi coletadas em três Estados: Paraná (Maringá, cinco ninhos; Altônia, quatro ninhos e Foz do Iguaçu, um ninho), São Paulo (Dracena, São Carlos e Santa Cruz do Rio Pardo, cinco ninhos de cada cidade) e Rondônia (Ariquemes, cinco ninhos). Foram testados dez pares de primers heterólogos de insetos que amplificam diferentes regiões do DNA mitocondrial, porém quatro (primers 1 - ND2 e COI; primers 2 - COI; primers 8 - 16S e 12S e primers 9 - COII) foram utilizados no estudo. Para a análise de restrição das regiões amplificadas foram testadas 13 enzimas: EcoRI, EcoRV, HindIII, HinfI, RsaI, PstI, XbaI, HaeIII, ClaI, XhoI, BglII, PvuII e ScaI. A amplificação com o par de primers 1 apresentou dois fragmentos, um com 2400 pb e outro com 900 pb. O fragmento amplificado pelo par de primers 1 correspondente a 2400 pb foi clivado com EcoRI e detectados três haplótipos que apresentaram polimorfismo entre os ninhos. O outro fragmento gerado pelo par de primers 1, corresponde a 900 pb e apresentou polimorfismo relacionado com a presença ou não deste fragmento intra e entre os ninhos. Nas amostras que apresentaram o fragmento de 900 pb houve clivagem com as enzimas HaeIII, HinfI e RsaI, porém não apresentaram polimorfismo. O fragmento amplificado pelo par de primers 2 de 1850 pb clivou com EcoRV e HinfI e não foi observado polimorfismo. Por meio da amplificação de regiões de DNA mitocondrial referente ao par de primers 8 seguido da clivagem com EcoRV e XbaI, foi possível verificar que a identificação morfológica difere daquela realizada com marcadores mitocondriais utilizados. Com a utilização do par de primers 9, foi possível identificar diferenças na amplificação quanto ao número de fragmentos, que permitiram agrupar e separar os ninhos de forma semelhante ao realizado com a utilização do par de primers 8 com EcoRV e XbaI. A análise de variância molecular mostra que 83% da variação ocorre entre as populações analisadas. O valor de ΦPT=0,834 (valor significativo ao nível de 0,001) indica que as populações estão diferenciadas. Quando as estimativas foram realizadas por meio de inferência Bayesiana o maior valor de delta K, para estimar o número real de populações, possibilitou verificar que K = 6 populações. O dendrograma baseado em Nei (1978) mostrou que as T. fiebrigi coletadas no Estado do Paraná apresentam coloração do mesepisterno e padrão de mtDNA que as agrupam, separando-as das demais abelhas jataí analisadas. O método de Monte Carlo via cadeias de Markov (MCMC) apresentou resultados similares aos do dendrograma de acordo com Nei (1978), com exceção do ninho 1 de Altônia, que apresentou características que o agrupou com as T. angustula. As T. fiebrigi coletadas no Estado de São Paulo (Dracena e São Carlos) apresentaram padrão de mtDNA das T. angustula, sendo agrupadas junto com estas. Assim, os marcadores mitocondriais utilizados permitiram verificar que há hibridação entre as duas espécies de Tetragonisca, que o início da especiação foi recente, o contato secundário tem permitido cruzamentos entre fêmeas de T. angustula e machos T. fiebrigi e pelo fato de ocorrer hibridação entre elas seria mais apropriado considerá-las como duas subespécies de T. angustula.
Palavras-chave	Abelha sem ferrão, primers heterólogos, PCR-RFLP, análise Bayesiana.
Title
Abstract	The meliponinae are important pollinators, participating in the maintenance of plant species. One of the most managed species is Tetragonisca angustula, popularly known as "jataí". Initially two subspecies were identified in T. angustula, T. angustula angustula and T. angustula fiebrigi. Subsequently, T. a. fiebrigi was considered as a species, based on the different coloration found in the thorax region called mesepisternum. Were described hybrids of the two species, as well as studies of nuclear molecular markers with isozymes, RAPD and microsatellites, which was presented controversial results. The objective of the present study was to obtain genetic markers that can differentiate the two species by amplifying regions of the mitochondrial DNA (mtDNA) followed by PCR-RFLP. T. angustula and T. fiebrigi worker bees, collected in three states: Paraná (Maringá five nests; Altônia four nests and Foz do Iguaçu, a nest), São Paulo (Dracena, São Carlos and Santa Cruz do Rio Pardo five nests each city) and Rondônia (Ariquemes, five nests). Ten pairs of insect heterologous primers which amplify different regions of the mitochondrial DNA were tested, but four (primers 1 - ND2 and COI; primers 2 - COI; primers 8 - 16S and 12S and primers 9 - COII) were used in the study. For restriction analysis of amplified regions 13 enzymes were tested: EcoRI, EcoRV, HindIII, HinfI, RsaI, PstI, XbaI, HaeIII, ClaI, XhoI, BglII, PvuII and ScaI. Amplification with pair primers 1 showed two fragments, one of 2400 bp and another of 900 bp. The fragment amplified by pair primers 1 corresponding to 2400 bp was cleaved with EcoRI and detected three haplotypes which presented polymorphism among the nests. The other fragment generated by pair primers 1 corresponds to 900 bp and showed polymorphism associated with the presence or absence of this fragment intra and among the nests. In samples with the 900 bp fragment cleaving with HaeIII, HinfI and RsaI enzymes has occurred, but did not present polymorphism. The fragment amplified by pair primers 2, 1850 bp, has cleaved with EcoRV and HinfI and polymorphism was not observed. Through amplification of mitochondrial DNA regions related to pair primers 8 followed by cleaving with EcoRV and XbaI, it was possible to identify that the morphological identification differs from the one performed with mitochondrial markers. Using pair primers 9, it was possible to identify differences in the amplification of the number of fragments which allow grouping and separating the nests in a similar way as using pair primers 8 with EcoRV and XbaI. The analysis of molecular variance shows that 83% of the variation occurs between the analyzed populations. The value of ΦPT = 0.834 (significant at 0.001 value) indicates that populations are differentiated. When the estimates were made by Bayesian inference the highest value of delta K, to estimate the actual number of populations, enabled us to verify that K = 6 populations. The dendrogram based on Nei (1978) showed that T. fiebrigi collected in Paraná State presented mesepisternum coloration and mtDNA pattern that groups them, separating them from other jataí bees analyzed. The method of Monte Carlo through Markov chains (MCMC) showed results similar to the dendrogram according to Nei (1978), with the exception of one nest of Altônia, which showed characteristics which grouped them with T. angustula. The T. fiebrigi collected in São Paulo State (São Carlos and Dracena) presented a T. angustula mtDNA pattern, being grouped with them. Thus the mitochondrial markers used allowed us to verify that there is hybridization between the two Tetragoniscas species, that the beginning of this speciation was recent, a secondary contact has allowed the crossing between T. angustula females and T. fiebrigi males and due to hybridization between them it would be more appropriate to consider them as two subspecies of T. angustula.
Key-words	Stingless bee, heterologous primers, PCR - RFLP, Bayesian analysis
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