Dissertação
Título	Análise da estrutura da região “OriC” de “Xylella fastidiosa”
Autor	Gimenes, Fabrícia
Unidade	Pós-Graduação em Genética e Melhoramento
Área de Concentração	Genética e Melhoramento
Orientador	Profª Drª Maria Aparecida Fernandez
Co-Orientador(es)	Profª Drª Claudete Aparecida Mangolin Profª Drª Maria Claudia Colla Ruvolo Takasusuki
Banca Examinadora	Profª Drª Maria Aparecida Fernandez Profª Drª Adriana Fiorini Profª Drª Maria Albertina de Miranda Soares
Data de Defesa	15/12/2006
Resumo	A clorose variegada dos citros (CVC) é causada pela bactéria “Xylella fastidiosa” a qual é restrita ao xilema da planta, disseminada por insetos vetores, afetando seriamente as plantações de laranja. O genoma de “X. fastidiosa” foi determinado e muitos genes de interesse estão em análise funcional. Nesses estudos, não foi possível obter essa bactéria transformada com plasmídeos recombinantes construídos com origens de replicação tradicionais. O conhecimento de que origens de replicação de procariotos apresentam motivos similares, não explica esse fato. Como a estruturação espacial pode ser determinante para o processo de replicação, estruturas alternativas de DNA nessas regiões são importantes. Curvaturas no DNA, induzidas por proteínas ou produzidas pela seqüência intrínseca, possibilita estabelecer uma relação entre estrutura e função. Esses sítios são produzidos pela presença de trechos ricos em A/T, repetidos aproximadamente a cada 10 pares de bases (pb). O objetivo desse trabalho foi investigar a presença de sítios de DNA “bent” intrínsecos no segmento que comporta a origem de replicação cromossomal, “oriC”, de “X. fastidiosa”. Nesse contexto, foram analisados os fragmentos de restrição da região de 1892pb que comporta a seqüência parcial 3’ do gene “rpmH”, a região intergênica de 141pb, o gene “dnaA”, a “oriC” e a seqüência parcial 5’ do gene “dnaN”. Essa análise mostrou duas regiões com redução da mobilidade eletroforética, indicando a presença de seqüências com curvatura. Programas computacionais possibilitaram o cálculo dos parâmetros helicais e a projeção bidimensional. Os parâmetros de curvatura mostraram três sítios de DNA “bent”, denominados “b1”, “b2” e “b3”, localizados, respectivamente, na região intergênica, no interior do gene “dnaA” e na extremidade 5’ da “oriC”. Outros parâmetros helicais confirmaram a presença de DNA curvo, característica essa descrita para regiões promotoras e origens de replicação, e com superenrolamento negativo, fator que intensifica a afinidade do segmento da “oriC” pela proteína DnaA. A trajetória 2D mostrou um segmento estruturado pelo efeito cumulativo dos sítios de DNA “bent”. Em resumo, os resultados obtidos evidenciam a localização de sítios de DNA “bent” na região promotora do gene “dnaA” (“b1”) e na “oriC” (“b3”). Análises funcionais devem esclarecer a possível participação desses elementos estruturais com a atividade funcional do DNA nesta região.
Palavras-chave	"oriC"; "Xylella fastidiosa"; DNA curvo
Title
Abstract	The citrus variegated chlorosis (CVC) is caused by the bacterium Xylella fastidiosa which is restricted to the plant xylema, disseminated by vector insects and affects seriously the orange plantations. The X. fastidiosa genome was determined, and several important genes are in functional analysis. In these studies, were not possible to achieve this bacterium transformed with recombinant plasmid constructed with traditional replication origins. The knowledge that prokaryotic replication origins have similar motifs, does not explain this fact. As the spatial structure can be decisive for the replication process, the analysis of the alternative structures of DNA in replication origins is important. DNA curvatures, induced by proteins or produced by intrinsic sequence, turn out possible to establish a relationship between structure and function. Intrinsic bent DNA sites are produced by adenine and/or thymine rich tracts, repeated approximately each 10 base pairs (bp). The objective of this work was to investigate the presence of intrinsic bent sites in X. fastidiosa replication chromosomal origin, oriC. Thus, were analyzed the restriction fragments of the 1892bp region that contains the rpmH gene 3’ partial sequence, an intergenic region with 141bp, dnaA gene, oriC and the 5’ partial sequence of the dnaN gene. This analysis showed two regions with electrophoretic mobility reduction, indicating the presence of sequences with curvature. Computer software made possible the calculation of the helical parameters and the 2D projection. The curvature parameters showed three bent DNA sites, b1, b2 and b3, located, respectively, in the intergenic region, inside the dnaA gene and in the oriC 5' extremity. Other helical parameters confirmed the presence of curved DNA, characteristic that is described to promoters and replication origins, and negative supercoil, that intensifies the binding to protein DnaA at the oriC segment. The 2D projection showed a structured segment by the cumulative effect of the bent DNA sites. In conclusion, the results showed bent DNA sites in the dnaA gene promoter region (b1) and oriC (b3). Functional analysis should explain the participation of those structural elements with the functional activity of DNA in this region.
Key-words	Replication origin; oriC; Xylella fastidiosa; Curved DNA
Arquivos	Nome Tamanho m-fgimenes.pdf 0,00 KB

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