Dissertação
Título	Identificação do gene hss1 em Crotalaria spectabilis (Fabaceae)
Autor	MELO, EDUARDO AUGUSTO DE
Unidade	Pós-Graduação em Genética e Melhoramento
Área de Concentração	Genética e Melhoramento
Orientador	ANDREA BEATRIZ MENDES BONATO
Co-Orientador(es)	indisponível
Banca Examinadora	ANDREA BEATRIZ MENDES BONATO ELIANE PAPA AMBROSIO ALBUQUERQUE MARIA DE FATIMA PIRES DA SILVA MACHADO
Data de Defesa	11/07/2024
Resumo	A Crotalaria spectabilis é uma leguminosa de grande importância para a agricultura mundial. Esta planta possui a capacidade de se adaptar a diversas condições ambientais, incluindo solos pobres em nutrientes, regiões de escassez hídrica e áreas arenosas. Além disso, é amplamente utilizada para cobertura de solo, produção de biomassa, fixação biológica de nitrogênio, e especialmente, no controle de nematoides. O controle de nematoides por plantas do gênero Crotalaria está intimamente associado a biossíntese de compostos secundários, particularmente os alcaloides pirrolizidínicos. A molécula de monocrotalina é exclusivamente produzida pela planta de C. spectabilis e possui propriedades nematicidas. A proteína HSS é a primeira enzima da rota metabólica da monocrotalina, resultado evolutivo da duplicação do gene dhs, que conecta o metabolismo primário ao secundário. Portanto, o objetivo deste estudo foi desenhar e validar os marcadores moleculares gerados para identificar e sequenciar o gene hss1 de C. spectabilis, visando a investigação dos genes da via de biossíntese da monocrotalina com potencial desenvolvimento de futuras biomoléculas destinadas ao uso como defensivos agrícolas. Dessa forma, foi realizada uma mineração de dados in silico, alinhamento das sequências, desenho dos primers, validação e sequenciamento do produto obtido. A partir da mineração foi identificada uma sequência de RNAm que correspondeu a enzima homospermidina sintase do gene hss1. O alinhamento com as famílias de plantas produtoras de alcaloides pirrolizidínicos foi efetuado utilizando a sequência do gene hss1 que revelou uma sequência de RNAm do gene dhs com valor de 83% de identidade. Foram selecionados 6 pares de primers dos 10 pares gerados para validação em laboratório, os quais corresponderam aos loci Hss1.2m, Hss1.3, Hss1.4, Hss1.5, Hss1.7m e Hss1.8. Todos os primers foram empregados na amplificação do gene hss1 a partir do DNA total de plantas de C. spectabilis, sendo todos validados quanto à sua eficiência. Após validação, o amplicon do locus Hss1.7m foi sequenciado, revelando uma sequência de 1019 nt, sendo maior dos x que o amplicon obtido in silico, sendo um forte indicativo de que os primers anelaram em diferentes exons, deixando visível que uma parte significativa do gene hss1.
Palavras-chave	homospermidina;metabolismo secundário;alcaloide pirrolizidínico
Title
Abstract	Crotalaria spectabilis is a legume of great importance to agriculture worldwide. This plant has the ability to adapt to diverse environmental conditions, including nutrient-poor soils, water-scarce regions and sandy areas. In addition, it is widely used for ground cover, biomass production, biological nitrogen fixation, and especially nematode control. Nematode control by plants of the Crotalaria genus is closely associated with the biosynthesis of secondary compounds, particularly pyrrolizidine alkaloids. The monocrotaline molecule is exclusively produced by the C. spectabilis plant and has nematicidal properties. The HSS protein is the first enzyme in the monocrotaline metabolic pathway, an evolutionary result of the duplication of the dhs gene, which connects primary and secondary metabolism. Therefore, the aim of this study was to design and validate the molecular markers generated to identify and sequence the hss1 gene of C. spectabilis, with a view to investigating the genes of the monocrotaline biosynthesis pathway with the potential to develop future biomolecules for use as agricultural pesticides. In this way, in silico data mining, sequence alignment, primer design, validation and sequencing of the product obtained were carried out. The mining identified a mRNA sequence that corresponded to the homospermidine synthase enzyme of the hss1 gene. Alignment with the families of plants that produce pyrrolizidine alkaloids was carried out using the sequence of the hss1 gene, which revealed a mRNA sequence of the dhs gene with an 83% identity value. Six pairs of primers were selected from the 10 pairs generated for validation in the laboratory, corresponding to loci Hss1.2m, Hss1.3, Hss1.4, Hss1.5, Hss1.7m and Hss1.8. All the primers were used to amplify the hss1 gene from the total DNA of C. spectabilis plants, and all were validated for their efficiency. After validation, the amplicon of the Hss1.7m locus was sequenced, revealing a sequence of 1019 nt, which is longer than the amplicon obtained in silico, and is a strong indication that the primers ring in different exons, leaving a significant part of the hss1 gene visible.
Key-words	homospermidine;secondary metabolism;pyrrolizidine alkaloid.
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