Tese
Título	Análise da região promotora do gene “Gmhsp17.6-L” em genótipos de soja resistentes e suscetíveis ao nematóide de galhas, “Meloidogyne javanica”
Autor	Fuganti, Renata
Unidade	Pós-Graduação em Genética e Melhoramento
Área de Concentração	Genética e Melhoramento
Orientador	Profª Drª Maria de Fátima Pires da Silva Machado
Co-Orientador(es)	Dr. Alexandre Lima Nepomuceno Profª Drª Claudete Aparecida Mangolin
Banca Examinadora	Profª Drª Maria de Fátima Pires da Silva Machado Profª Drª Claudete Aparecida Mangolin Drª Francismar Corrêa Marcelino Prof. Dr. Carlos Alberto de Bastos Andrade Dr. Alexandre Lima Nepomuceno
Data de Defesa	11/12/2007
Resumo	Espécies de nematóide do gênero Meloidogyne provocam sérias perdas na produção de soja. As perdas anuais na produção mundial são estimadas em 11% devido a este parasitismo. Marcadores moleculares associados a genes de resistência podem acelerar o desenvolvimento de cultivares resistentes. O marcador molecular microssatélite 176 Soy HSP mostrou alta correlação com o número de galhas em raízes de soja inoculadas com o patógeno. Uma análise de QTL revelou a presença de pelo menos um gene localizado próximo ao marcador 176 Soy HSP, com valor de LOD score de 27.5. O fragmento amplificado, presente inicialmente apenas em amostras suscetíveis, mostrou 100% de similaridade com a região promotora do gene que codifica uma proteína de choque térmico de baixo peso molecular, presente na soja, Gmhspi17.6-L (Número de acesso no GenBank: M 11317). Primers foram desenhados para amplificar a região em ambos os genótipos resistente e suscetível. Todos os fragmentos também mostraram 100% de similaridade com a região promotora do gene Gmhsp17.6-L. Dentro da região promotora, uma inserção de microssatélite correspondente a repetições AT(n) foi observada em todas as amostras. No entanto, o número de repetições AT era diferente em cada genótipo testado, com amostras resistentes apresentando maior número de repetições AT(n), quando comparadas com amostras suscetíveis e também com a seqüência do gene Gmhsp17.6-L disponível no GenBank. Na seqüência de DNA correspondente à região codante da proteína, nenhuma diferença significativa na seqüência nucleotídeos e aminoácidos foi encontrada entre todas as amostras e a seqüência do GenBank. Para confirmar se a diferença no tamanho da inserção AT, dentro da região promotora do gene Gmhsp17.6-L, refletia em diferentes níveis de expressão deste gene, um ensaio de proteção de ribonucleases foi realizado, mas nenhuma diferença foi detectada nos indivíduos parentais. Finalmente, uma quantificação relativa por PCR em tempo real foi executada. Os resultados indicaram que entre todas as amostras testadas, os indivíduos resistentes, JF7002, JF7027 e JF7056, inoculados com o nematóide, mostraram maior nível de expressão gênica quando comparados com todas as amostras restantes. Embriões de soja foram transformados com cassetes de expressão construídos com diferentes tamanhos de inserção AT(n) na região promotora. Depois de submetidos a estresses abióticos e biótico, a cultivar BRS133 mostrou melhor resultado no ensaio histoquímico para detectar expressão do gene Gus. As plantas transformadas estão sendo mantidas em câmera para período de aclimatação, até que amostras possam ser coletadas para confirmação de eventos positivos, via PCR, com prïmers específicos.
Palavras-chave	Soja, Nematóide de galhas, Proteína de choque térmico.
Title	Promoter region analysis of a Glycine max small heat-shock protein gene (Gmhsp17.6-L) in soybean plants resistant and susceptible to Meloidogyne javanica
Abstract	Nematode species of the genus Meloidogyne causes severe yield losses in soybean production. It is estimated that 11 % of the annual losses in world production result from this parasitism. Molecular markers associated with resistance genes can accelerate the development of resistant cultivars. The microsatellite molecular marker 176 Soy HSP showed high correlation with the number of galls in soybean roots inoculated with the pathogen. The QTL analysis revealed the presence of at least one gene located next to the 176 Soy HSP marker, with a LOD score of 27.5. The amplified fragment, present at first only in susceptible samples showed 100% similarity with a promoter region of a small heat-shock protein (sHSP) gene found in soybean, Gmhsp17.6-L (GenBank accession number M11317). Primers were designed to amplify this region in both resistant and susceptible genotypes. All fragments also showed 100% similarity with promoter region of Gmhsp17.6-L gene. Inside the promoter region a microsatellite insertion, corresponding to a AT(n) repetitions was observed in all samples. However the number of AT repetitions was different in each genotype tested, with resistant samples presenting a higher number of AT(n) repetitions when compared to susceptible samples and also to the sequence from gene Gmhspl7.6-L available in GenBank. In heat shock protein coding region no significant mismatch was found in nucleotide and aminoacid sequence between sequences from all samples and sequence from GenBank. To confirm if this difference in the length of AT insertion in the Gmhspl7.6-L promoter region reflect in different levels of protein expression, a ribonuclease protection assay was performed but no difference was detected in the parental individuals. Finally, a real time polymerase chain reaction relative quantification was performed. Results indicated that among all samples, resistant individuals JF7002, JF7027 and JF7056 inoculated with the nematode showed higher gene expression level, when compared all remaining samples. Soybean embryos were transformed with expression cassettes built with different sizes of AT(n) repetitions inside promoter region. After submitted to diverse stresses, BRS133 cultivar showed better results in the histochimic assay done to detect Gus gene expression. Transformed plants are being kept in chamber for acclimatization until collection of samples to confirm positive events, through PCR with primers specific.
Key-words	Soybean, Gall nematode, Heat-shock protein.
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